Introducción
Son técnicas que permiten observar microorganismos en función de la capacidad de los mismos para retener o no determinadas sustancias colorantes, lo que depende de la carga de la célula y del colorante.
Los colorantes pueden ser de distintos tipos:
Catiónicos. Son sustancias que tienen carga positiva. Penetran en el interior de las células y las tiñen. Ejemplos: azul de metileno, cristal violeta, safranina.
Aniónicos. Con carga negativa. No penetran en el interior celular, de modo que no tiñen las células, sino el entorno. En este caso se habla de tinción negativa. Ejemplos: eosina,nigrosina.
Liposolubles. Se
mezclan con los lípidos celulares y los tiñen. Ejemplo: negro
sudán.
Las tinciones pueden Ser:
Simples. Utilizan un solo colorante. Se basan en el hecho de que las células tienen una composición química diferente a la de su entorno, de modo que ambos se comportan de forma diferente frente a un colorante. El colorante tiñe las células (azul de metileno, safranina) o no (nigrosina).
Diferenciales. Se basan en el hecho de que distintos tipos de células tienen distinta composición química, y por lo tanto reaccionan de forma diferente frente a una tinción, lo que permite clasificar lo microorganismos en diferentes grupos, según su
capacidad de tinción. En este apartado están dos tinciones de importancia
taxonómica y médica: la tinción de Gram y la de ácido-alcohol resistencia (de Ziehl-Neelsen). Estas tinciones utilizan más de un colorante.
Selectivas. Se basan en el hecho de que distintas estructuras celulares tienen distinta composición química, de modo que se tiñen selectivamente con ciertos colorantes. Ej; tinción de esporas, de flagelos, de paredes celulares, de corpúsculos metacromáticos. Pueden utilizarse uno o más colorantes.
a) Azul de metileno (Tinción positiva). Permite teñir el interior celular. Tiñe microorganismos procarióticos (vivos o muertos). Los eucarióticos sólo se tiñen si Están muertos. Algunas estructuras, como los corpúsculos metacromáticos, se tiñen más intensamente con este colorante que el resto de la célula.
b) Nigrosina (Tinción negativa). Se trata de un colorante aniónico, que no penetra en el interior celular. Proporciona una visión de la forma y el tamaño celulares al observarse los microorganismos brillantes sobre un fondo oscuro.
Objetivos
1.Realizar una tinción simple de bacterias procedentes de distintas muestras naturales.
2.Realizar dos tipos de fijaciones bacterianas y saber en qué casos se recomienda una u otra.
3. Observar la morfología bacteriana y aprender a distinguir los distintos tipos de agrupaciones que existen.
4.Practicar con el microscopio al máximo aumento y con el correcto empleo del aceite de inmersión.
MATERIAL
· Mechero Bunsen o de alcohol
·Asa de siembra o aguja ebmangada
·Pinzas
·Portaobjetos
·Muestras bacterians de origen natural: yogurt, vinagre, sarro dental,
suelo,etc.
·Colorantes para tinción:
a) Solución de cristal violeta
b) Solución de safranina al 0.5%
c)Azul de metileno al 1%
Microscopio y aceite de inmersión.
BACTERIAS DEL YOGURT
El yogur es un producto lácteo producido por la fermentación natural de la leche. A escala industrial se realiza la fermentación añadiendo a la leche dosis del 3-4% de una asociación de dos cepas bacterianas: elStreptococcus termophilus, poco productor de ácido, pero muy aromático, y el Lactobacillus ulgaricus, muy acidificante. En esta preparación se podrán, por tanto, observar dos morfologías bacterianas distintas (cocos y bacilos) y un tipo de agrupación (estreptococos, cocos en cadenas arrosariadas). Además, el tamaño del lactobacilo (unos 30µm de longitud) facilita la observación aunque no se tenga mucha práctica con el enfoque del microscopio.
Procedimiento
1.Extension: Realizar el frotis disolviendo una mínima porción de yogur en una pequeña gota de agua.
2.Fijación Fijar con metanol o Xilol para eliminar parte de la grasa.
3. Teñir Apoyar el portaobjetos sobre el soporte de tinciones y añadir unas gotas de azul de metileno o con un colorante cualquiera de los arriba indicados durante 4-5 minutos
4.Lavar con agua destilada
5.Secar. pasar el portaobjetos varias veces por encima de la llama del mechero de alcohol, sin permitir que llegue a hervir, hasta que se seque.
6.añadir una gota de glicerina y colocar el cubreobjetos
7.Observar primero con el objetivo 40×; luego se añade aceite de inmersión y se observa con el objetivo 100×
BACTERIAS DEL VINAGRE
El vinagre es una solución acuosa rica en ácido acético resultante de la
fermentación espontánea del vino o de bebidas alcohólicas de baja graduación. La acetificación del vino es producida por bacterias aeróbicas del ácido acético, principalmente Acetobacter aceti,aunque también Gluconobacter. Se trata de bacilos rectos con flagelos polares.
1.Tomar
con una aguja enmangada una pequeña porción de madre de vinagre natural o de la telilla que se forma sobre la superficie de los vinos agriado.
2. Extender la muestra en el portaobjetos con una gota de agua y hacer el
frotis.
3. Dejar secar y fijar con calor.
4. Teñir 2-3 minutos, lavar el exceso de colorante y secar.
BACTERIAS DEL SARRO DENTAL
El sarro dental es un depósito consistente y adherente localizado sobre el esmalte de los dientes. Está constituido principalmente por restos proteicos, sales minerales y bacterias junto con sus productos metabólicos. La flora bacteriana de la cavidad bucal es muy variable dependiendo de las condiciones que se den en el momento de hacer la preparación, pero suelen abundar bacterias saprófitas, pudiéndose observar gran variedad de morfologías: espiroquetas, cocobacilos,
diplococos y bacilos.
1. Con una aguja enmangada tomar una pequeña porción de sarro dental y disolverla en una gota de agua sobre el portaobjetos.
2. Dejar secar y fijar con calor.
3. Teñir 2-3 minutos, lavar el exceso de colorante y secar.
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